中国科学院生物物理研究所张宏课题组的早期工作发现,研究发现在出生后小鼠心肌细胞中敲除Wdr1会导致心肌肥大

2014年5月19日,国际学术期刊《The American Journal of
Pathology》杂志发表了我校模式动物研究所杨中州课题组与陈炯课题组的合作研究成果“A
Cardiomyocyte-Specific Wdr1 Knockout Demonstrates Essential Functional
Roles for Actin Disassembly during Myocardial Growth and Maintenance in
Mice”。该论文主要阐述了哺乳动物细肌丝解聚因子WDR1所介导的肌动蛋白解聚在小鼠出生后生长发育阶段以及成年阶段的作用,是首次在脊椎动物肌肉中对Wdr1进行详尽的遗传学分析,探索Wdr1在哺乳动物心肌细胞中的功能,揭示ADF/cofilin及Wdr1介导的肌动蛋白动力学(actin
dynamics)对肌纤维形成及维持过程中的作用。博士研究生袁白银和万萍为该论文的共同第一作者,通讯作者为我校模式动物研究所陈炯教授和杨中州教授。

通过线虫遗传筛选的方法,中国科学院生物物理研究所张宏课题组的早期工作发现,epg-6基因是一个重要的多细胞生物特有的自噬基因。epg-6基因在哺乳动物中的同源基因为WDR45/WIPI4WDR45编码一个含有WD40重复序列的PtdInP结合蛋白。

心脏搏动过程中,心肌细胞中钙离子在细胞浆与肌浆网之间穿梭是实现心肌兴奋-收缩耦联的关键步骤,这一过程发生紊乱会导致包括心衰在内的诸多心脏疾病。因此,在由于细胞浆/肌浆网钙穿梭异常导致的心脏疾病治疗中,恢复心肌细胞的钙稳态是一种非常诱人的药物研发策略。心肌细胞中,SERCA2a是一个位于肌浆网上的钙-ATP酶,其主要功能是通过水解ATP介导钙离子从细胞浆到肌浆网内的转运,从而控制心肌舒张。在成熟的小鼠心肌细胞中,大约95%的胞浆钙离子是由SERCA2a重新回收到肌浆网内的。SERCA2a表达量或活性降低都延迟会肌浆网对钙离子的重回收,进而导致肌肉舒张/收缩减弱。因此,以SERCA2a为分子靶点恢复心肌细胞钙稳态、进而治疗心衰等心脏疾病具有非常大的前景。然而,SERCA2a功能调控机制到目前为止尚不十分清楚,而此类调控机制的解析有助于为以SERCA2a为靶点进行药物研发提供新思路。

肌动蛋白动力学在肌肉的发育和功能方面发挥着至关重要的作用,引起肌动蛋白动力学失调的基因突变会引起各种与肌肉相关的疾病。作为肌动蛋白解聚因子ADF/cofilin的主要辅助因子,WDR1/AIP1
(actin-interacting protein 1)能够促进ADF/cofilin
所介导的对actin的解聚作用,WDR1的功能在真核生物中是高度保守的。有文章报道在人类中,cofilin的突变会引起杆状体肌病(nemaline
myopathy),而关于WDR1在肌肉中作用的遗传学证据目前仅来自对线虫的研究,缺失或突变WDR1会导致线虫body
wall
muscle肌纤维结构的紊乱,WDR1在脊椎动物肌肉中的功能目前还没有被报道。

人类遗传学研究发现,WDR45基因的突变可以引起一种神经退行性疾病——BPAN(beta-螺旋蛋白相关的神经退行性疾病),这种疾病是NBIA(伴随铁聚积的神经退行性疾病)的一种亚型。

2018年12 月19日,模式动物研究所陈帅教授课题组在国际主流期刊《Circulation
Research》上在线发表题为“SPEG Controls Calcium Re-uptake Into The
Sarcoplasmic Reticulum Through Regulating SERCA2a By Its Second
Kinase-Domain
”的论文。该研究从蛋白质组学入手,发现SERCA2a可以与横纹肌特异性表达的蛋白激酶相互作用;通过一系列深入研究证明了SPEG是SERCA2a的一个全新调控因子,可调控钙离子在细胞浆与肌浆网之间的穿梭。这项研究揭示了心脏钙稳态调控的一种新机制,为钙稳态异常导致的心脏疾病的发病机理及治疗提供了新思路。

在本项研究中,我校模式动物研究所博士生袁白银,万萍等人在出生后小鼠心肌细胞及成年小鼠心肌细胞中将WDR1的编码基因Wdr1进行特异性的敲除。研究发现在出生后小鼠心肌细胞中敲除Wdr1会导致心肌肥大,心脏收缩功能下降以及心脏电活动的异常;Wdr1敲除的小鼠从出生后第13天开始猝死。进一步的研究发现,从出生后第10天开始,Wdr1敲除小鼠的心肌细胞肌小节结构受到严重的破坏并伴随有F-actin
(filamental
actin)的堆积,在F-actin堆积的肌纤维处,肌小节的一些结构蛋白比如a-actinin,Tmod1的分布紊乱,这些表型在出生后第12天的小鼠心脏中更加明显。体外实验进一步验证了哺乳动物WDR1和cofilin在肌肉肌动蛋白动力学中发挥的作用,研究还发现cofilin在F-actin堆积的肌纤维处富集。这些结果表明WDR1介导的对actin的解聚功能在小鼠心脏生长过程中发挥着必不可少的作用。在成年小鼠心脏中敲除Wdr1会产生类似但相对比较温和的表型,这提示着成年心肌细胞需要比幼年心肌细胞相对较少的actin的解聚功能来维持心肌细胞的功能。

为了研究WDR45基因在哺乳动物中的功能,张宏课题组构建了神经系统特异性敲除Wdr45基因的小鼠(Nes-Wdr45fl/Y小鼠)。Wdr45基因敲除小鼠会出现运动协调性降低现象,并且学习记忆功能严重受损。组织病理和免疫组化研究发现,Wdr45基因敲除小鼠脑内出现严重轴突水肿,并伴有大量嗜酸性小体聚积,而且自噬通路受到抑制,在神经元和水肿的轴突中自噬底物SQSTM1和ubiquitin明显累积。

SPEG属于肌球蛋白轻链激酶亚组钙调蛋白激酶丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的一员。其C端含有两个串联的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域,其第一个激酶结构域与MLCK亚组的其他成员具有更高的同源性。之前有研究表明,SPEG不仅是心脏发育所必需的、也是维持成年小鼠心脏功能所必不可少的;但是到目前为止仍然不清楚SPEG是如何来调控心脏功能的。

此项研究获得国家科技部和国家自然科学基金委经费资助。

综上所述,Wdr45基因的小鼠(Nes-Wdr45fl/Y小鼠)出现部分与BPAN患者类似的表型,包括认知障碍和轴突稳态失衡。因此该项研究有助于进一步了解BPAN的发病机制,同时也有助于深入研究自噬在维持轴突稳态中的作用。

在本篇研究中,陈帅教授课题组首先通过蛋白质组学分析鉴定出SERCA2a是潜在的可以与SPEG发生相互作用的蛋白。研究人员利用免疫共沉降实验证明无论在体内还是体外,SPEG与SERCA2a都存在相互作用。随后通过在细胞系以及新生大鼠原代心室心肌细胞中进行一系列的实验,他们发现SPEG的第二个激酶结构域可以与SERCA2a相互作用、并直接磷酸化SERCA2a的Thr484位点,进而促进SERCA2a的寡聚化,最终增强SERCA2a转运钙离子的能力。

5月22日,Autophagy 杂志在线发表了这项研究成果,文章题为The autophagy
gene Wdr45/Wipi4 regulates learning and memory function and axonal
homeostasis

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张宏课题组博士后赵燕为该文的第一作者。该项目得到了国家自然科学基金、科技部重大科学研究计划和青年科学基金项目的支持。而且该研究也得到霍华德-休斯国际青年科学家奖的资助。

图一 SPEG-SERCA2a轴线调控心肌细胞钙离子稳态与心功能

文章链接

小干扰RNA是一种常见的基因沉默工具,进入细胞后可以引发相应基因的信使RNA快速降解。利用siRNA在NRVC敲降SPEG后,SERCA2a-Thr484的磷酸化水平及肌浆网的钙离子回流都受到了抑制,说明SPEG可以调控SERCA2a的功能。此外,将SERCA2a的Thr484位点突变成不能磷酸化的丙氨酸后,相较于野生型SERCA2a而言,
过表达SERCA2aThr484Ala突变蛋白的NRVC中肌浆网钙离子回流时间延长,进一步说明该磷酸化位点是SERCA2a的关键活性调控位点。

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为进一步研究SPEG-SERCA2a这一轴线的在体功能,陈帅教授课题组利用Cre-loxp系统在成年小鼠心脏中特异性敲除Speg基因。与对照小鼠相比,SPEG心脏特异性敲除小鼠罹患严重的扩张型心肌炎,心功能显著降低、并随时间推移不断恶化,最终过早死亡。他们的机制研究显示,缺失SPEG的小鼠心脏中SERCA2a-Thr484的磷酸化水平以及寡聚化都显著降低;最为重要的是,在SPEG心脏特异性敲除小鼠的心功能发生异常之前,其心肌细胞中肌浆网的钙离子回流已经受到抑制。这些结果表明,SPEG-SERCA2a调控轴线具有重要的在体功能,SERCA2a功能受损是SPEG心脏特异性敲除小鼠发生心衰的重要原因。

Nes-Wdr45fl/Y小鼠出现学习记忆功能障碍和轴突水肿

综上,该项研究发现了心肌细胞中SERCA2a功能调控的全新机制,并且阐明了SPEG是恢复心肌细胞钙稳态以及心衰等心脏疾病治疗的新的分子靶标。

模式动物研究所博士生全超和李敏为本文共同第一作者,南京大学陈帅教授为本文通讯作者。

(模式动物研究所 科学技术处)

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